《Nature communications》是自然出版集團(tuán)（Nature Publishing Group）旗下的一本開(kāi)放獲?。∣pen Access）綜合性學(xué)術(shù)期刊，

于2010年創(chuàng)刊。

出版周期：Bimonthly；

影響因子：14.7；

ISSN：2041-1723；

發(fā)文量：7910篇/年；

審稿速度：平均1.0個(gè)月；

版面費(fèi)：USD 6790.00；

一、研究背景與目標(biāo)

B7H3（CD276）是一種高度N-糖基化的膜蛋白，在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)，通過(guò)抑制T細(xì)胞功能促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，但具體糖基化位點(diǎn)對(duì)其

功能的調(diào)控機(jī)制尚不明確。N-糖基化影響蛋白折疊、運(yùn)輸和降解。異常糖基化可導(dǎo)致蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中積累并通過(guò)ER相關(guān)降解（ERAD）

途徑清除。該研究聚焦于免疫檢查點(diǎn)分子B7H3的N -糖基化修飾，揭示了其在腫瘤免疫逃逸中的關(guān)鍵作用，并開(kāi)發(fā)了靶向糖基化B7H3的

單克隆抗體，為腫瘤免疫治療提供了新策略。

二、關(guān)鍵技術(shù)總結(jié)

1、通過(guò)CRISPR-Cas9、sgRNA技術(shù)構(gòu)建敲除細(xì)胞系，研究糖基化位點(diǎn)功能；

2、采用WB、IP、IF、FCM的方法檢測(cè)B7H3表達(dá)、定位、泛素化及與其他蛋白互作；

3、構(gòu)建荷瘤小鼠和人源化模型驗(yàn)證B7H3糖基化對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響及抗體治療效果；

4、單克隆抗體篩選技術(shù)及SPR篩選特異性抗體并分析其結(jié)合特性；

5、TCGA數(shù)據(jù)分析驗(yàn)證B7H3表達(dá)與臨床預(yù)后及免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性；

三、主要研究結(jié)果

1、B7H3的N-糖基化位點(diǎn)對(duì)其細(xì)胞表面定位和蛋白穩(wěn)定性的影響

構(gòu)建人類(lèi)B7H3的NQ突變體（將天冬酰胺N突變?yōu)楣劝滨０?/span>Q），包括全突變體8NQ、N91/104/309/322Q（僅這 4 個(gè)位點(diǎn)無(wú)法糖基化）及

單一位點(diǎn)恢復(fù)突變體，示意圖顯示野生型B7H3的4對(duì)糖基化位點(diǎn)（N91/309、N104/322、N189/407、N215/433）；在MDA-MB-231和A549細(xì)胞

中穩(wěn)定表達(dá)突變體，流式分析顯示N91/104/309/322Q突變體的膜結(jié)合B7H3水平與8NQ突變體相似，且mRNA水平無(wú)顯著差異，排除轉(zhuǎn)錄水平影響；

小鼠B7H3的N91/104Q 突變體在4T1、E0771、B16F10細(xì)胞中膜表達(dá)量顯著低于野生型，與4NQ 突變體相當(dāng)；用蛋白合成抑制劑CHX處理細(xì)胞，

發(fā)現(xiàn)N91/104/309/322Q突變體的B7H3降解速率快于野生型，而蛋白酶體抑制劑MG132可逆轉(zhuǎn)該降解。MG132 處理后，N91/104/309/322Q突變體

的K48-linked泛素化水平顯著升高，提示通過(guò)ERAD途徑降解。結(jié)果表明，N91/309和 N104/322位點(diǎn)的N-糖基化是B7H3細(xì)胞表面定位和

蛋白穩(wěn)定性的主要決定因素，缺失這些糖基化會(huì)導(dǎo)致B7H3在ER中積累并通過(guò)蛋白酶體降解。

圖1、B7H3前體的細(xì)胞表面定位和穩(wěn)定性維持依賴于其N91/N309和N104/N322位點(diǎn)的N-糖基化修飾

2、B7H3糖基化位點(diǎn)N91/309和N104/322突變對(duì)其亞細(xì)胞定位及ER-Golgi轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

隨后，通過(guò)免疫熒光染色和共定位分析，在穩(wěn)定表達(dá)野生型（WT）或糖基化突變型B7H3 的腫瘤細(xì)胞中，觀察B7H3的亞細(xì)胞定位及與

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）、ER-Golgi中間區(qū)（ERGIC）和高爾基體標(biāo)志物的共定位情況。結(jié)果表明，野生型B7H3主要分布于細(xì)胞膜和核周的高爾基體

區(qū)域，而N91/104/309/322Q突變體和8NQ突變體的B7H3在細(xì)胞質(zhì)中廣泛分布，且與ER 標(biāo)記物KDEL的共定位顯著增加，提示B7H3在ER中積累

；另外，野生型B7H3可與ERGIC和高爾基體標(biāo)志物（TGN38）共定位，而N91/104/309/322Q突變體和8NQ突變體與上述標(biāo)志物的共定位

明顯降低，表明糖基化缺失阻斷了B7H3從ER向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)；

圖2、B7H3在N91/309和N104/322位點(diǎn)的糖基化缺失會(huì)導(dǎo)致其無(wú)法正常從ER轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，進(jìn)而在ER中積累并被降解。

3、糖基化修飾通過(guò)調(diào)控ERAD途徑影響B7H3穩(wěn)定性的分子機(jī)制

隨后，通過(guò)免疫沉淀-質(zhì)譜（IP-MS）、蛋白質(zhì)降解實(shí)驗(yàn)及泛素化分析，在穩(wěn)定表達(dá)野生型（WT）或糖基化突變型B7H3的細(xì)胞中，

研究糖基化缺失對(duì)ERAD途徑的激活作用。

圖3、糖基化修飾通過(guò)調(diào)控ERAD途徑影響B7H3穩(wěn)定性的分子機(jī)制

IP-MS分析結(jié)果表明，N91/104/309/322Q和8NQ突變體的B7H3與ERAD途徑組分（如 p97、HRD1、SEL1L）的結(jié)合顯著增加，

通路富集分析顯示ERAD相關(guān)通路顯著激活；使用 p97 ATP酶抑制劑（NMS-873、CB-5083）或蛋白酶體抑制劑（MG132）處理

細(xì)胞后，N91/104/309/322Q和8NQ突變體的B7H3降解被顯著抑制，表明p97介導(dǎo)的ERAD途徑參與其降解；泛素化水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)

N91/104/309/322Q和8NQ突變體的B7H3總泛素化及K48-linked泛素化水平顯著升高，而p97抑制劑處理進(jìn)一步增強(qiáng)該泛素化；

免疫共沉淀顯示 N91/104/309/322Q突變體的B7H3與ERAD核心組件HRD1、SEL1L的結(jié)合顯著增強(qiáng)，敲低HRD1或SEL1L后，

N91/104/309/322Q突變體的B7H3降解速率顯著降低，K48-linked 泛素化水平也隨之下降，證實(shí)HRD1和SEL1L在ERAD中的關(guān)鍵作用。

這些結(jié)果表明B7H3 在N91/309和N104/322位點(diǎn)的糖基化缺失會(huì)使其被ERAD途徑識(shí)別，通過(guò)HRD1-SEL1L 復(fù)合物介導(dǎo)K48-linked泛素化，

進(jìn)而被p97依賴的蛋白酶體降解。

4、B7H3抑制T細(xì)胞增殖和活化依賴于N91/309和N104/322位點(diǎn)的糖基化

CFSE標(biāo)記的人T細(xì)胞與輻照的MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，表達(dá)WT或 N91/104/309/322糖基化B7H3的腫瘤細(xì)胞顯著抑制

CD4+和CD8+T 細(xì)胞的增殖（CFSE稀釋減少），而N91/104/309/322Q或8NQ突變體的抑制作用明顯減弱；OT-1 T細(xì)胞與OVA肽負(fù)載的

E0771/B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)，糖基化B7H3組的T細(xì)胞增殖抑制更顯著。WT或N91/104糖基化B7H3組的IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻率顯著低于突變體組，

表明T細(xì)胞活化受抑制。另外，在小鼠模型中，糖基化B7H3組的穿孔素+和TNF+ CD8+T細(xì)胞比例降低，進(jìn)一步證實(shí) T細(xì)胞效應(yīng)功能被抑制。

表達(dá)WT或N91/104糖基化B7H3的腫瘤細(xì)胞與活化T細(xì)胞共培養(yǎng)后，cleaved caspase-3+腫瘤細(xì)胞比例更低，存活腫瘤細(xì)胞更多，

而突變體組對(duì)T細(xì)胞殺傷更敏感。此外，糖基化位點(diǎn)突變不影響腫瘤細(xì)胞的體外增殖能力（生長(zhǎng)曲線、集落形成實(shí)驗(yàn)），

且不影響PI3K/AKT/mTOR和MAPK等增殖相關(guān)信號(hào)通路，排除了非免疫機(jī)制的影響。這些結(jié)果表明，B7H3在N91/309和N104/322位點(diǎn)的糖基化

是其抑制T細(xì)胞增殖和活化的關(guān)鍵，該修飾通過(guò)維持B7H3的免疫抑制功能，使腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷。

這一結(jié)果為靶向糖基化B7H3的免疫治療提供了直接的體外機(jī)制證據(jù)。

圖4、B7H3在N91/309和N104/322位點(diǎn)的糖基化對(duì)其體外抑制T細(xì)胞功能的調(diào)控作用

5、B7H3在N91和N104位點(diǎn)的糖基化對(duì)體內(nèi)抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)控作用

隨后，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究了B7H3在N91和N104位點(diǎn)的糖基化對(duì)抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)控作用，通過(guò)小鼠荷瘤模型和臨床數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，

驗(yàn)證了糖基化B7H3對(duì)腫瘤免疫逃逸的促進(jìn)作用。結(jié)果表明，重構(gòu)N91/104糖基化B7H3的腫瘤生長(zhǎng)顯著快于N91/104Q突變體，而耗竭 

CD8+ T細(xì)胞后，兩組腫瘤生長(zhǎng)差異消失，提示依賴CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。并在 C57BL/6小鼠中獲得類(lèi)似結(jié)果，N91/104糖基化

B7H3腫瘤生長(zhǎng)更快，且與CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)減少相關(guān)。此外，N91/104糖基化B7H3腫瘤中，IFN-γ+ CD8+ T、TNF+ CD8+ T、IFN-γ+ CD4+ T 

及 TNF+ CD4+ T細(xì)胞比例顯著低于N91/104Q突變體腫瘤，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（FOXP3+ Treg）無(wú)明顯差異。在嚴(yán)重免疫缺陷SCID小鼠中

，重構(gòu)N91/104和N91/104Q B7H3的腫瘤生長(zhǎng)無(wú)差異，進(jìn)一步證實(shí)依賴適應(yīng)性免疫。此外，TCGA分析顯示33種人類(lèi)癌癥中，高B7H3 mRNA

表達(dá)與患者總生存期縮短顯著相關(guān)，且B7H3表達(dá)與腫瘤內(nèi)CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明B7H3在N91和N104位點(diǎn)的糖基化

通過(guò)抑制CD8+ T細(xì)胞活化和浸潤(rùn)，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。該結(jié)果在小鼠模型和臨床數(shù)據(jù)中均得到驗(yàn)證，為靶向糖基化B7H3的免疫治療提供了

體內(nèi)機(jī)制依據(jù)。

圖5、B7H3在N91和N104位點(diǎn)的糖基化通過(guò)抑制CD8+ T細(xì)胞活化和浸潤(rùn)，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。

6、糖基化特異性B7H3抗體Ab-82的篩選和鑒定 

通過(guò)單B細(xì)胞抗體生成技術(shù)篩選特異性識(shí)別糖基化B7H3的單克隆抗體，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、表面等離子體共振（SPR）及免疫印跡等方法

驗(yàn)證其結(jié)合特性。用重組人4Ig-B7H3-His 融合蛋白免疫日本白兔，提取脾細(xì)胞通過(guò)單B細(xì)胞技術(shù)生成抗體，經(jīng)ELISA和流式細(xì)胞術(shù)篩選出

優(yōu)先結(jié)合N91/309/N104/322糖基化B7H3的Ab-82；驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Ab-82可識(shí)別野生型（WT）和N91/309/N104/322糖基化B7H3，但不結(jié)合

N91/309/N104/322Q突變體或去糖基化B7H3（PNGase F處理后）。

圖6、糖基化特異性B7H3抗體Ab-82的生成過(guò)程及其結(jié)合特異性驗(yàn)證

SPR分析顯示Ab-82與B7H3的解離常數(shù)（KD）為3.0×10?⁹M，表明高親和力結(jié)合，與商業(yè)抗B7H3抗體（eBioscience）相比，Ab-82對(duì) 

N91/309/N104/322Q突變體的結(jié)合不受HRD1敲除（ERAD抑制）的影響，證實(shí)其依賴糖基化的特異性。免疫沉淀（IP）分析發(fā)現(xiàn)，

Ab-82優(yōu)先結(jié)合WT和N91/309/N104/322糖基化 B7H3，不結(jié)合8NQ或N91/309/N104/322Q突變體，而商業(yè)抗體可結(jié)合所有形式的B7H3；

Dot blot 驗(yàn)證表明，去糖基化的B7H3蛋白無(wú)法被Ab-82識(shí)別，進(jìn)一步證明其依賴糖基化位點(diǎn)的結(jié)合特性。

7、Ab-82的體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制及人源化抗體的療效及作用機(jī)制研究

在4T1-hB7H3 荷瘤小鼠中，Ab-82（0.25–1 mg/kg）顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，且1 mg/kg組腫瘤重量較對(duì)照組降低約70%，無(wú)明顯肝腎功能毒性；

而在huPBMC-NOG小鼠中，5 mg/kg Hu-Ab-82使A549腫瘤體積減少約60%，且腫瘤內(nèi)人類(lèi)CD8+ T細(xì)胞和GZMB+細(xì)胞比例顯著增加。

Ab-82處理后，MDA-MB-231和A549細(xì)胞的膜表面B7H3表達(dá)量呈劑量依賴性下降，而商業(yè)抗B7H3抗體不影響膜B7H3水平。pHrodo Red標(biāo)記的

Ab-82在37℃下可進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，且內(nèi)吞量隨時(shí)間增加（24 h達(dá)峰值），而低溫（4℃）或內(nèi)吞抑制劑（primaquine）可阻斷該過(guò)程；此外，

Ab-82優(yōu)先介導(dǎo)WT和N91/309/N104/322糖基化B7H3的內(nèi)吞，對(duì)8NQ或 N91/309/N104/322Q 突變體的內(nèi)吞作用顯著減弱。同時(shí)，

Ab-82處理增加4T1腫瘤中 CD4+/CD8+ T細(xì)胞比例，且GZMB+細(xì)胞（細(xì)胞毒性T細(xì)胞標(biāo)志物）數(shù)量顯著增多；免疫組化顯示，Ab-82處理組

腫瘤組織的B7H3表達(dá)量較對(duì)照組降低約50%，伴隨T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷增強(qiáng)。這表明Ab-82通過(guò)特異性結(jié)合糖基化B7H3，誘導(dǎo)其內(nèi)化與降解，

解除B7H3對(duì)T細(xì)胞的抑制，從而激活抗腫瘤免疫應(yīng)答。人源化抗體Hu-Ab-82在人源化模型中驗(yàn)證了療效與安全性，為靶向糖基化B7H3的

免疫治療提供了臨床轉(zhuǎn)化依據(jù)。

四、全文結(jié)論

本研究證實(shí)B7H3的N91/309和N104/322 糖基化位點(diǎn)是其發(fā)揮免疫抑制功能的關(guān)鍵，靶向該位點(diǎn)的抗體Ab-82可通過(guò)誘導(dǎo)B7H3內(nèi)化和降解，

激活抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答。這一發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)基于糖基化位點(diǎn)的免疫治療藥物提供了新思路，有望成為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。

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Tang J, Zhu XF, Deng R. Targeting site-specific N-glycosylated B7H3 induces potent antitumor immunity. Nat Commun. 2025 Apr 14;16(1):3546. 

doi: 10.1038/s41467-025-58740-3. PMID: 40229277; PMCID: PMC11997214.