人非小細(xì)胞肺癌裸鼠原位種植轉(zhuǎn)移模型的建立：（1）探討肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和阻斷其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的研究；（2）模擬晚期非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的自然發(fā)生過(guò)程；（3）在活體動(dòng)物的完整器官內(nèi)評(píng)估瘤細(xì)胞播散和腫瘤的生長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)方法原理         

將表達(dá)GFP的質(zhì)粒pRNAT-U6/Neo轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞A549，G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP細(xì)胞，對(duì)比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的生長(zhǎng)活性和成瘤性。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞原位種植裸鼠預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)處死。HE染色和免疫組化檢測(cè)轉(zhuǎn)移灶的位置和數(shù)目。利用KODAK  IS2000MM系統(tǒng)檢測(cè)腫瘤播散情況。

實(shí)驗(yàn)材料         

BALB c nu nu裸鼠腺癌細(xì)胞株A549

試劑、試劑盒        

小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液pRNAT-U6 Neo磷酸鈣即用型SP超敏 感免疫組化染色試劑盒DAB Kit 顯色試劑盒甲醛EDTA

儀器、耗材     

熒光顯微鏡光學(xué)顯微鏡

實(shí)驗(yàn)步驟     

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

1.  BALB/c nu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周齡，體重18-20 g，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)飼養(yǎng)。

2.  肺腺癌細(xì)胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibcobrl公司)，5% CO237℃培養(yǎng)，常規(guī)傳代。

3.  質(zhì)粒和篩選藥物質(zhì)粒pRNAT-U6/Neo(美國(guó)Genscript公司)，攜帶Neomycin耐藥基因供篩選，在CMV啟動(dòng)子控制下編碼cGFP作為轉(zhuǎn)染標(biāo)記物。G418(美國(guó)Promega公司)800 μg/ml初篩后200 μg/ml維持篩選。

二、細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

1.   哺乳動(dòng)物磷酸鈣轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(美國(guó)Promega公司)，按照操作指南將質(zhì)粒pRNAT-U6/Neoo轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24~48 h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

2.  后培養(yǎng)液內(nèi)加G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

3.  利用平板克隆形成試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞克隆形成率>10%后，有限稀釋法獲得表達(dá)GFP陽(yáng)性細(xì)胞。

4.  1月后收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，常規(guī)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加G418(200 μg/ml)維持篩選。

5.  測(cè)定轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，對(duì)比轉(zhuǎn)染前后A549細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長(zhǎng)活性是否受轉(zhuǎn)染的影響。

6.  待細(xì)胞增殖達(dá)一定數(shù)量后，裸鼠皮下注射轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞，記錄成瘤時(shí)間，用公式V=1/2×長(zhǎng)×寬 計(jì)算腫瘤體積，對(duì)比轉(zhuǎn)染前后兩組裸鼠的瘤體大小以檢測(cè)成瘤性是否有差別。

三、人肺腺癌A549裸鼠原位種植模型的建立

1.  取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，用不含血清的RMPI 1640培養(yǎng)液沖洗2次并調(diào)整細(xì)胞最終濃度為5×106/0.2 ml備用。

2.  用0.5%的麻醉50 mg/kg)(中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司)腹腔注射麻醉裸鼠，用26號(hào)針頭吸取細(xì)胞懸液0.2 ml注射入裸鼠左側(cè)胸腔，注射過(guò)程中注意控制刺入針頭的深度。

3.  整個(gè)操作過(guò)程在細(xì)胞收獲后半小時(shí)內(nèi)完成，嚴(yán)格遵循無(wú)菌原則。

4.  注射后在KODAK IS2000MM下確認(rèn)原位種植成功，注射部位為胸腔。

5.  注射后繼續(xù)飼養(yǎng)，隔天觀察一次并記錄體重。

6.  當(dāng)裸鼠出現(xiàn)精神萎靡、呼吸短促、弓背并明顯消瘦，體重較注射Et減輕20%時(shí)，頸椎脫位術(shù)處死裸鼠。

7.  開(kāi)胸觀察，取出器官，用10%甲醛固定保存。

四、檢查項(xiàng)目

1.  轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光顯微鏡成像轉(zhuǎn)染后24～48 h熒光顯微鏡下觀察，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功。單克隆化過(guò)程中鏡下觀察細(xì)胞克隆生長(zhǎng)情況。

2.  活體GFP標(biāo)記成像檢測(cè)應(yīng)用KODAK IS2000MM進(jìn)行活體熒光成像，確認(rèn)注射部位為胸腔，后間斷應(yīng)用以活體確認(rèn)瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

3.  解剖學(xué)與組織學(xué)檢查處死的裸鼠均經(jīng)

詳細(xì)解剖學(xué)檢查，取出器官、固定包埋后，以4 tun厚度連續(xù)切片，切片嚴(yán)格編號(hào)，奇數(shù)號(hào)行HE染色，光鏡觀察，以初步確定轉(zhuǎn)移灶。

4.  免疫組織化學(xué)染色

選擇肺臟、肝臟和腦作為主要研究器官，在HE染色確定轉(zhuǎn)移灶位置的基礎(chǔ)上，取相鄰偶數(shù)號(hào)碼的切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，CEA鼠抗人單克隆抗體(ZM-0062)，LRP鼠抗人單克隆抗體(ZM．0335)工作液，即用型SP超敏感免疫組化染色試劑盒(sP-9000)、抗原修復(fù)液、DAB Kit顯色試劑盒(zU一9032)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

細(xì)胞的生長(zhǎng)活性和腫瘤體積x±s表示，數(shù)值的比較采用方差分析。HE檢測(cè)結(jié)果和活體成像檢測(cè)結(jié)果的比較用x2檢驗(yàn)。采用SPSSl3．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。